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蛋白質(zhì)是人類營(yíng)養(yǎng)三要素之一,它是人體內(nèi)一切組織的基本組成,它在生命現(xiàn)象和生命過程中起著決定性的作用。因此說蛋白質(zhì)是維持生命所不可缺少的物質(zhì)。人體不能合成蛋白質(zhì),只能從食物中攝取,而食物中的蛋白質(zhì)則是人體獲取蛋白質(zhì)的一個(gè)重要來源。因此通過測(cè)定食品中粗蛋白質(zhì)含量的多少,可以評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,為合理利用食品資源,科學(xué)安排人民群眾的膳食結(jié)構(gòu)提供科學(xué)依據(jù)。

目前,食品中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定,是采用GB/ T500915- 2003《食品中蛋白質(zhì)測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)中第一法:凱氏微量定氮法作為基本方法的。凱氏定氮法使用到的儀器有全自動(dòng)凱氏定氮儀或者簡(jiǎn)稱為蛋白質(zhì)測(cè)定儀。蛋白質(zhì)是由多種氨基酸組成的天然高聚物,而氨基酸則是由羧酸分子中烴基上的一個(gè)或幾個(gè)氫原子被氨基取代后所生成的化合物,為一類含氮的有機(jī)化合物,同種食品中的蛋白質(zhì),其所含各種氨基酸的組成及種類有一個(gè)固定的比例,不同種的食品中其蛋白質(zhì)所含各種氨基酸的比例略有不同。總的來說,食品中的蛋白質(zhì)的含氮量約在15 - 19 % ,其中小麥中的蛋白質(zhì)含氮量較高,約為1715 %左右,而其它谷物及豆類中蛋白質(zhì)的含氮量約為16 %左右,根據(jù)此含氮百分比,通過測(cè)定食品中的含氮量即可換算出蛋白質(zhì)的百分含量。

凱氏微量定氮法就是通過測(cè)定試樣中的氮的含量,然后換算成蛋白質(zhì)的含量。凱氏微量定氮法試驗(yàn)原理為:將粉碎的試樣在硫酸鉀─硫酸銅混合物的催化作用下中,加入硫酸加熱消化,其中所含的蛋白質(zhì)與硫酸反應(yīng),蛋白質(zhì)的主要成份碳、氫、氧分別生成了二氧化碳、水等,而蛋白質(zhì)中氨基酸中的氨基─NH2 則由于不易被氧化而得到一個(gè)氫原子生成氨(NH3 ) ,氨與過量的硫酸反應(yīng)生成銨鹽即硫酸銨[ (NH4) 2SO4 ] ,在消化后所得到的含硫酸銨的消化液里加入過量的堿,使溶液呈堿性,通過加熱使硫酸銨分解生成氨并被蒸餾出來,然后用硼酸吸收蒸餾出來的氨,生成四硼酸氫銨(NH4HB4O7 ) ,最后用酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中和其中的氨,從而定量的計(jì)算出氨的含量,最后換算成蛋白質(zhì)的含量。因?yàn)樵谑称分?除蛋白質(zhì)外,還含有其它有機(jī)含氮化合物,其中所含的氮在硫酸的作用下,也有一部分能反應(yīng)生成氨,所以此方法測(cè)得的氮的含量,包括了非蛋白質(zhì)中有機(jī)含氮化合物中的氮,所以用此法測(cè)得的蛋白質(zhì)的結(jié)果,不是純蛋白質(zhì)的結(jié)果,而稱之為粗蛋白質(zhì)的結(jié)果。如需測(cè)定純蛋白質(zhì)的含量,則需將試樣中非蛋白質(zhì)的有機(jī)含氮化合物分離出去,然后再采用凱氏微量定氮法進(jìn)行測(cè)定。得到的結(jié)果即是純蛋白質(zhì)的結(jié)果。總的來說,凱氏微量定氮法包括三個(gè)過程:消化、蒸餾、滴定。其各過程的主要反應(yīng)如下:

蛋白質(zhì)測(cè)定之消化:

RCHNH2COOH + H2SO4 →H2O + CO2 ↑+ SO2 ↑+(NH4) 2SO4

RCHNH2COOH 為蛋白質(zhì)中氨基酸的結(jié)構(gòu)通式,其中R 為烴基。

蛋白質(zhì)測(cè)定之蒸餾:

(NH4) 2SO4 + NaOH →NH3 ↑+ Na2SO4NH3 + H3BO3 →NH4HB4O7

蛋白質(zhì)測(cè)定之滴定:

NH4HB4O7 + HCl →NH4Cl + H3BO3

應(yīng)用凱氏微量定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)試樣用量少,反應(yīng)復(fù)雜,如操作條件掌握不好;試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性比較差。通過多年應(yīng)用凱氏微量定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)的實(shí)踐,總結(jié)出影響粗蛋白質(zhì)測(cè)定的因素有以下幾點(diǎn):

1 　稱樣量

測(cè)定粗蛋白質(zhì)時(shí)要注意試樣的稱樣量不能太大,尤其是對(duì)蛋白質(zhì)含量較高的試樣,如大豆等。如果稱樣量大: ①消化時(shí)間長(zhǎng),硫酸的消耗量大,也容易造成消化不完全,蛋白質(zhì)中的氮不能完全轉(zhuǎn)化為氨,可導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低; ②消化時(shí)比較激烈,泡沫較多,也易導(dǎo)致消化不完全。所以稱樣是應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)含量的大約范圍,按含粗蛋白質(zhì)不超過30 毫克來計(jì)算試樣稱用量。

2 　試樣的消化過程對(duì)粗蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的影響

試樣的消化是影響粗蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的一個(gè)重要因素,由于消化時(shí)試樣少,溫度高,反應(yīng)激烈,消化條件如掌握不好也容易引起消化時(shí)間增長(zhǎng),消化不完全,或造成試樣中的部分氮損失等。以筆者多年實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),樣品消化時(shí)要注意以下幾個(gè)方面: ①試樣中加入硫酸銅和硫酸鉀是起提高反應(yīng)溫度,加快反應(yīng)速度的作用,但加入的硫酸鉀不可過多,因?yàn)榱蛩徕浖尤肓窟^多,可導(dǎo)致消化液的沸點(diǎn)過高,從而使消化液的溫度過高,在過高的溫度下,硫酸會(huì)形成細(xì)小液滴攜帶試樣而被蒸出,從而使氮損失造成結(jié)果偏低。②剛開始消化時(shí)要嚴(yán)格控制溫度,只能做較低溫度的加熱,不能過高,最好使用可調(diào)電爐,或在電爐上多加幾層石棉網(wǎng),避免溫度過高。因?yàn)閯傞_始消化時(shí),消化比較激烈,泡沫也比較多,溫度高,消化過于激烈沸騰,易造成試樣隨液體噴濺出來,或隨泡沫溢出燒瓶,使試樣損失,尤其是含脂肪較高的試樣,試樣在加熱極易產(chǎn)生大量泡沫并溢出平外。而且消化過快時(shí),易引起副反應(yīng),可能使部分氮被氧化變成分子狀態(tài)揮發(fā)逸出,造成結(jié)果偏低;消化時(shí)過于激烈沸騰,泡沫也會(huì)將試樣濺到瓶壁上、瓶頸處,高溫焦化后不易洗脫,尤其是濺到瓶頸處,更不易洗脫下來,也容易造成后期消化困難和消化不完全,使結(jié)果偏低。所以消化時(shí),一般需微微加熱(10～20)min 后,泡沫減少,消化液大部分呈灰黑色透明液,二氧化硫白色煙霧增加時(shí),方可升高溫度,使溶液保持微沸狀態(tài),因?yàn)榇藭r(shí)消化液中有許多由試樣形成的炭化顆粒。

盡管前期消化時(shí)間長(zhǎng)一些,但形成的炭化顆粒少,可使后期消化的時(shí)間大大減少,消化完全。③在消化后期,對(duì)濺附在燒瓶壁上的黑色焦化物質(zhì),須轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶將其振洗下來,以避免試樣損失。在消化過程中,如硫酸———過氧化氫———水混合液消耗量大,則應(yīng)酌情補(bǔ)加部分混合液繼續(xù)消化,以避免燒瓶干枯,溫度過高,造成硫酸銨過熱分解,造成氨的損失。

3 　蒸餾過程對(duì)粗蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的影響

蒸餾時(shí)加入蒸餾瓶?jī)?nèi)的堿溶液必須過量,因?yàn)樵谙�化液中還有一部分硫酸,因此加入的堿液一部分將與硫酸中和,過量的堿溶液將使消化液保持較強(qiáng)的堿性,有利于使消化液中的氨完全蒸出,必要時(shí)可酌情多加一部分堿液。在蒸餾瓶中加入稀釋后的消化液前,應(yīng)注意要先將接受瓶及接受液(硼酸溶液) 準(zhǔn)備好,并將冷凝管插入接受液的液面下,因?yàn)樵诩尤胂�化液�?再加入過量的堿溶液時(shí),消化液中的氨易揮發(fā)逸出;另外,在蒸餾瓶多次使用時(shí),蒸餾瓶本身也具有一定溫度,也易加快氨的逸出,這些都會(huì)影響分析結(jié)果準(zhǔn)確性。以上是在粗蛋白質(zhì)測(cè)定實(shí)踐中總結(jié)出的幾點(diǎn)膚淺的經(jīng)驗(yàn),在操作時(shí),應(yīng)嚴(yán)格遵守國(guó)際操作規(guī)程,掌握好操作條件,在操作中,應(yīng)盡量避免氮的損失,可以取得比較準(zhǔn)確的分析結(jié)果。