飼料脂肪水平對吉富羅非魚體脂沉積及脂肪酸組成的影響
飼料脂肪營養(yǎng)是影響魚體組織發(fā)育的因素之一， 飼料中的脂肪水平直接影響魚體脂肪含量，魚體脂肪酸組成有接近于飼料中脂肪酸組成的傾向， 而不同組織的脂肪含量及脂肪酸與飼料脂肪水平及脂肪酸的相關(guān)度有一定的差異。飼料中脂肪水平不合理會造成魚類體內(nèi)脂肪蓄積， 當(dāng)飼料提供的脂肪大于魚體的需求時， 會對魚體的增重產(chǎn)生負(fù)作用。研究飼料脂肪水平對魚類形體及脂肪沉積的影響， 可以更加清楚魚體對脂肪的適宜需求量， 探討飼料的脂肪酸組成對魚體的影響可以進(jìn)一步揭示脂肪營養(yǎng)對魚類脂肪代謝的調(diào)控作用。吉富羅非魚是遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚。經(jīng)過多年選育的吉富品系羅非魚具有生長速度快、魚體高、背厚、出肉率高、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點， 現(xiàn)已成為中國一個新的重要養(yǎng)殖品種， 但對吉富羅非魚的營養(yǎng)需求的研究尚少， 因此， 本研究探討了飼料脂肪營養(yǎng)對吉富羅非魚部分形體指標(biāo)、脂肪沉積及脂肪酸組成的影響， 著重分析了吉富羅非魚肌肉、肝臟及腹腔脂肪含量和脂肪酸組成與飼料脂肪水平關(guān)系，探討了魚體對脂肪的利用能力及體脂沉積的規(guī)律，為飼料脂肪水平的合理設(shè)置及脂肪營養(yǎng)對脂肪代謝的調(diào)控提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗魚種
實驗魚采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心種苗基地同一批孵化魚苗， 經(jīng)過 5%食鹽水消毒后， 用普通商品飼料馴養(yǎng)20d，備用。馴化結(jié)束后，選擇健康無傷病的630尾馴養(yǎng)后的吉富羅非魚幼魚， 體質(zhì)量(2.63±0.16)g，體長為(4.36±0.11)cm。隨機分配到18個水族箱中，每個水族箱35尾，然后將18個水族箱隨機分為6個組，每組3個重復(fù)，分別投喂不同脂肪水平的實驗飼料，飼養(yǎng)90d。
1.2 實驗飼料
參照SC/T1025-2004 羅非魚配合飼料水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計配方(表1)， 以優(yōu)質(zhì)進(jìn)口魚粉、豆粕為蛋白源，優(yōu)質(zhì)魚油(國產(chǎn)魚油)為脂肪源， 飼料原料均過60目篩，利用脂肪測定儀對飼料中脂肪進(jìn)行測定，對魚油的添加水平分別為0%、2%、4%、6%、8%和15%， 飼料脂肪添加水平分別為 1.73%、3.71%、5.69%、7.67%、9.64%和16.55%。配制成6組實驗飼料，經(jīng)充分混合后加工成顆粒飼料，晾干并保存于冰箱中備用。
1.3 飼養(yǎng)管理
實驗采用循環(huán)流水飼養(yǎng)系統(tǒng)養(yǎng)殖(水族箱尺寸： 100 cm×80 cm×60 cm)， 每 5 天換水1 次， 新加入水量為總水量的 40%。每天投飼 3 次， 時間分別為 6：30、13：30、18：30， 投飼率為 10%~15%， 投喂之前吸除糞便。實驗用水為曝氣后的自來水，水溫 22~27℃， pH 6.8~8.0， 溶解氧>5mg/L。
1.4 樣品采集
飼養(yǎng)實驗結(jié)束時，停止投喂48 h后，對每尾魚進(jìn)行稱重，并測量體長。每一水族箱隨機取9尾進(jìn)行解剖，取出內(nèi)臟稱重，然后將肝臟分離出來稱重。分離出背部肌肉、肝臟、腹腔脂肪組織樣品， 放入 70~80℃超低溫冰箱中，待做脂肪酸分析。
1.5 形體指標(biāo)計算
本實驗計算的形體指標(biāo)有： 肥滿度、臟體指數(shù)、肝體指數(shù)， 具體的計算公式如下：
1.6 脂肪含量測定方法
取新鮮樣品1g，低溫真空干燥12h，干燥溫度為36℃。干燥完成后，將組織磨碎，用索氏抽提法提取脂肪：提取劑為沸程30~60℃乙醚；提取時間6h；水浴溫度控制在70℃左右；提取劑約8min 回流1次；提取完成后，得到橙黃色黏稠狀魚油，然后計算樣品中脂肪含量。
1.7 脂肪酸組成測定方法
分析樣品中脂肪提取參照Folch方法。油脂的皂化及甲酯化方法參照Christie方法略有改進(jìn)。樣品皂化甲酯化后，直接上氣相色譜—質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。氣相色譜—質(zhì)譜分析條件如下：分析儀器：Thermo Quest Trace GC/MS；色譜柱：SUPELCO GC/MS 毛細(xì)柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm； 氣相色譜操作條件： 氣化室溫度 250℃；傳輸線溫度280℃；色譜柱升溫程序：初溫50℃，以10 ℃/min 升至 280℃并保持10 min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣， 分流比為 10∶1；進(jìn)樣量：1μL；質(zhì)譜：EI 離子源， 信增器電壓：1200 V。離子源溫度：230℃。四極桿溫度： 150℃， 全掃描(SCAN)質(zhì)量范圍：45~500 mau；檢索NIST質(zhì)譜圖庫， 比較樣品質(zhì)譜圖與圖庫中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖。就可以確定樣品中脂肪酸種類，各脂肪酸相對含量的確定采用面積歸一化法計算。
1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
原始數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2007初步整理后，用SAS9.0 中的單因子方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行LSD 法多重比較， 顯著水平為 P<0.05。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤( x ± SE)形式表示。
2 結(jié)果與分析
2.1 吉富羅非魚形體指標(biāo)
吉富羅非魚肥滿度隨著飼料脂肪水平提高呈拋物線的變化，5.69%組、7.67%組和 9.64%組的肥滿度值較高， 這個3個組之間差異不顯著(P>0.05)，但是顯著高于其他組(P<0.05)(圖 1)。1.73%和16.55%組的肝體指數(shù)顯著高于其他組(P<0.05)，1.73%與 16.55%組之間差異不顯著(P>0.05)， 其他4 個組之間差異不顯著(P>0.05)(圖2)。除去1.73%組， 其他組中飼料脂肪水平越高， 魚體的臟體指數(shù)越高， 1.73%組臟體指數(shù)高于 3.71%組且低于7.67 %、9.64 %及 16.55 %組， 差異均顯著(P<0.05)(圖3)。
2.2 吉富羅非魚肌肉、肝臟及腹腔脂肪組織的脂肪含量
從表2可知， 吉富羅非魚魚體組織中脂肪含量由高到低依次為： 腹腔脂肪、肝臟、肌肉。吉富羅非魚腹腔脂肪組織的脂肪含量穩(wěn)定，各個組之間差異不顯著(P>0.05)； 肌肉和肝臟組織的脂肪含量易受飼料脂肪水平的影響，飼料中脂肪水平提高， 肌肉和肝臟中脂肪含量隨之增加。7.67%組吉富羅非魚肌肉中脂肪含量顯著高于3.71%組(P<0.05)，同時顯著低于16.55%組(P<0.05)。但是其肝臟中脂肪含量與其他各組差異均不顯著(P>0.05)。
2.3 飼料及糞便中脂肪酸組成
實驗飼料的脂肪源為魚油，各組飼料中的脂肪酸組成比例隨飼料脂肪水平提高而逐漸接近魚油(表 3)。魚油中脂肪組成比例從大到小順序為MUFA (單不飽和脂肪酸)、SFA(飽和脂肪酸酸)、PUFA(多不飽和脂肪酸)， 魚油中∑n-3 PUFA 比例較高，而基礎(chǔ)飼料原料中的∑n-6 PUFA 較高， 因此隨著魚油添加量增加飼料中∑n-3/∑n-6 系數(shù)是逐漸遞增的，同時總PUFA 比例基本不變， 占總脂肪酸的29.49%~32.00%。另外，魚油中的C14：0(肉豆蔻酸)、C15：0(十五烷酸)及C16：n-9(棕櫚油酸)組成比例高于 1.73%組飼料，C18：n-9(油酸)和C20：n-9(蓖麻油酸)低于1.73%組飼料。
本次實驗還嘗試性地檢測了糞便中的脂肪酸組成(表 4)。由于糞便中的脂肪含量較低， 因此只檢測到了含量較高的脂肪酸種類。實驗發(fā)現(xiàn)， 部分飽和脂肪酸、C18：2n-6(亞油酸)及 n-9 MUFA 未被吸收利用而隨糞便排出體外。隨飼料脂肪水平提高， 糞便中飽和脂肪酸比例成上升趨勢， n-9MUFA 呈下降趨勢， 其中16.55%組中 SFA 比例約為1.73%組的2倍。糞便中n-3 PUFA幾乎沒有， 但是檢測到C18：2n-6脂肪酸， 其比例占糞便中脂肪酸的1%~7.11%，且隨著飼料脂肪水平提高呈下降趨勢。在糞便的 SFA 中， C16：0比例高于其他SFA，在 MUFA中，C18：n-9比例高于其他n-9 MUFA， C16：0與C18：n-9呈現(xiàn)此消彼長的關(guān)系， 直接影響到SFA與∑n-9 的比例關(guān)系。
2.4 吉富羅非魚肌肉、肝臟及腹腔脂肪組織的脂肪酸組成
吉富羅非魚肌肉中脂肪酸組成與飼料中脂肪酸顯著相關(guān)，肌肉脂肪酸組成反映了飼料的脂肪酸組成(表5)。飼料脂肪水平越高， 肌肉中SFA 的比例越低，其隨著各組飼料脂肪水平的提高，C16：0和C18：0比例下降，但C14：0卻是上升的趨勢，這一變化趨勢與各組飼料中該脂肪酸的變化趨勢一致。飼料脂肪水平提高， 肌肉中C16：0、C18：0、C18：2n-6及C18：n-9比例隨之下降， 同時C14：0、C17：0、C20：5n-3、C22：6n-3及C20：n-9比例上升， 與飼料中對應(yīng)的脂肪酸的變化規(guī)律相關(guān)性很高。隨飼料脂肪水平提高， 肌肉中∑n-3/∑n-6 系數(shù)顯著升高(P<0.05)，其變化范圍是 0.90%~4.02%， 總 PUFA 也顯著升高(P<0.05)， 范圍在 17.86%~30.01%之間。
吉富羅非魚肝臟中脂肪酸組成同樣與飼料脂肪酸組成具有較高的相關(guān)性， 但對比肌肉來講，其相關(guān)性沒有肌肉高(表6)。隨著飼料脂肪水平提高， 肝臟中 SFA 出現(xiàn)下降趨勢， n-3 PUFA 呈現(xiàn)上升趨勢，這與飼料中的脂肪酸變化規(guī)律相同， 但肝臟中 n-9 MUFA 比例受飼料影響較小。
由表7可知，在3.71%組到 16.55%組之間，隨著飼料脂肪水平提高， 腹腔脂肪中 SFA 比例呈下降趨勢， 其中 3.71%組顯著高于 16.55%組。
3 討論
3.1 飼料脂肪水平對吉富羅非魚形體指標(biāo)的影響本次實驗發(fā)現(xiàn)，1.73%組與16.55%組中吉富羅非魚肝臟占魚體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比其他組高(圖2、圖3)，肝臟腫大，但是1.73%組魚的肝臟呈現(xiàn)鮮紅色而16.55%組是青灰色，說明16.55%組肝臟已經(jīng)出現(xiàn)病理上的變化。類似的研究結(jié)果有：研究發(fā)現(xiàn)鱈飼料中脂肪含量超過14%時，其肝體指數(shù)和肝脂含量顯著升高；馮健等對紅姑魚的研究表明，紅姑魚的各期生長率和存活率隨著飼料脂肪含量增加而顯著下降，紅姑魚肝胰臟脂肪含量與飼料脂肪水平成正比， 各組紅姑魚均發(fā)生程度不同的營養(yǎng)性脂肪肝病，其病變程度與飼料脂肪水平成正相關(guān)；研究認(rèn)為奧尼羅非魚幼魚飼料中脂肪添加量超過4%時對其肝臟形態(tài)學(xué)與組織學(xué)有一定影響。因此，合理的脂肪營養(yǎng)是預(yù)防魚類肝臟疾病的關(guān)鍵因素。通過本實驗對吉富羅非魚4個形體指標(biāo)的測算得出，飼料脂肪水平為7.67%和 9.64%的2組之間，魚體的肥滿度、肝體指數(shù)、臟體指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，當(dāng)飼料脂肪水平達(dá)到16.55%時，魚體肝體指數(shù)和臟體指數(shù)較高，這一變化可能是肝臟分解脂肪的代謝負(fù)擔(dān)加重導(dǎo)致組織增大，同時也發(fā)現(xiàn)飼料脂肪水平為1.73%的脂肪組中，魚體的肝體指數(shù)也較高，其原因可能是飼料中的糖類轉(zhuǎn)化成脂肪造成的，高糖低脂的飼料會加劇脂肪的生物合成，導(dǎo)致肝臟體積增大。
3.2 飼料脂肪水平對吉富羅非魚組織中脂肪含量的影響
脂肪營養(yǎng)的一個重要的生物功能是為魚體提供能量，飼料中提供的脂肪過量，大量的脂肪能夠在魚體沉積成為體脂。一般而言魚類肌肉組織，含有脂肪1%~10%，除種類差別之外，同時受年齡、季節(jié)及營養(yǎng)狀況等影響而變動。當(dāng)飼料中脂肪含量增加，魚體組織中的脂肪含量也隨之增加而出現(xiàn)脂肪蓄積的情形。本次實驗中，吉富肌肉脂肪含量范圍為2.29%~4.27%，肝臟為7.38%~12.73%，腹腔脂肪組織為74.12%~83.04%。
其中肌肉和肝臟的脂肪含量均隨飼料脂肪水平增加而升高，吉富羅非魚肌肉和肝臟組織中脂肪含量與飼料脂肪水平顯著相關(guān)。肝臟中脂肪的含量整體上高于肌肉，隨著飼料脂肪水平改變，7.67%組吉富羅非魚肌肉中脂肪含量顯著高于3.71%組(P<0.05)，但是其肝臟中脂肪含量與其他各組差異均不顯著(P>0.05)，說明肝臟中脂肪含量變化比肌肉更穩(wěn)定，這與肝臟和肌肉所具有的不同生理功能有關(guān)。腹腔脂肪組織中沉積了大量的脂肪，其受飼料脂肪水平的影響較小，飼料中的脂肪水平高低可能主要影響腹腔脂肪組織沉積的重量占魚體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以上說明，吉富羅非魚肝臟和肌肉很容易蓄積脂肪，由于腹腔脂肪組織粘附在腸道上，分離較為困難，不容易精確稱重， 因此沒有計算其占魚體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，腹腔脂肪組織的脂肪含量雖然穩(wěn)定，但是其占魚體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可能會隨飼料脂肪水平增加而升高， 有待改進(jìn)實驗技術(shù)進(jìn)行驗證。
3.4 飼料脂肪水平對吉富羅非魚體脂肪酸組成的影響魚體組織中脂肪酸組成受飼料中脂肪酸組成的影響很大，組織中脂肪酸比例與飼料中脂肪酸比例呈線性關(guān)系。本次實驗使用的脂肪源為魚油， 魚油中n-3 和n-6 PUFA 的比例分別為23.83%、3.07%，不含魚油的1.73%組基礎(chǔ)飼料中的n-3 和 n-6 PUFA 的比例分別為7.42%、24.66%，隨著飼料中魚油添加量的增加， 飼料中n-3和n-6PUFA 的比例出現(xiàn)變化， 但總 PUFA 基本保持不變占總脂肪酸的30%左右。飼料脂肪水平提高，吉富羅非魚肌肉和肝臟中的總 PUFA 比例是增加的，主要是因為魚油中含有大量的 n-3 PUFA，導(dǎo)致魚體肌肉和肝臟中的n-3PUFA 比例增加。吉富羅非魚體(包括肌肉、肝臟及腹腔脂肪組織)中主要的SFA、MUFA、PUFA分別是C16：0、C18：n-9、C18：2n-6和C22：6n-3，其比例的變化與飼料中脂肪酸比例一致， 但它們在魚體中的變化幅度明顯小于飼料中的變化幅度，同樣其他各種脂肪酸及脂肪酸大類也幾乎都呈現(xiàn)這種現(xiàn)象， 這說明吉富羅非魚肌肉脂肪酸組成具有相對穩(wěn)定性，這可能是由于魚體脂肪為結(jié)構(gòu)脂肪， 其脂肪酸組成需要保持一定的穩(wěn)定性，以維持機體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，在對溪紅點鮭、銀大麻哈魚、金頭鯛的研究中也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果。
3.5 吉富羅非魚對飼料中脂肪酸的吸收及轉(zhuǎn)化能力此次實驗檢測了吉富羅非魚糞便中的脂肪酸組成，以往的研究者對魚類糞便脂肪酸的分析較少，將吉富羅非魚糞便中脂肪組成與飼料脂肪酸組成對比，目的是探討魚體對脂肪酸的吸收利用能力。實驗發(fā)現(xiàn)， 糞便中的脂肪酸與飼料對比，C14：0的下降幅度大于C16：0和C18：0， 但是仍然有一定比例的C14：0未被利用而排除體外，短鏈的C14：0是否比較長鏈的C16：0和C18：0更容易被魚體吸收，有待進(jìn)一步的研究驗證。吉富羅非魚對PUFA的吸收能力較強，尤其對 n-3 PUFA 吸收較高，而對C18：2n-6的吸收利用有限，在其他的研究者的實驗中也獲得相似的結(jié)論。
魚類脂質(zhì)合成主要路徑由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪酸合成酶催化，脂肪酸合成酶主要產(chǎn)物為飽和脂肪酸C16：0和C18：0。n-3、n-6 及n-9 等3種不飽和脂肪酸系列都采用類似的去飽合和增長碳鏈反應(yīng)，形成同系列較長碳鏈及較高不飽和度的脂肪酸。
通常尼羅羅非魚魚體中的C18：3n-3比例為0.5%左右。本實驗使用的魚油中，沒有檢測到C18：3n-3，卻檢測0.73%的C16：3n-3。在吉富羅非魚的肝臟、肌肉及腹腔脂肪中均檢測到C16：3n-3， 其含量相對于添加的魚油， 其比例要低(表 3、表 5、表 7)， 進(jìn)一步說明了飼料的脂肪酸組成與魚體有較高的相關(guān)性。一般認(rèn)為C18：3n-3、C20：5n-3、C22：6n-3及C18：2n-6是魚類的必需脂肪酸。本實驗各組不同脂肪水平的飼料中未檢測出C18：3n-3， 一方面可能是由于飼料中C18：3n-3過低， 而魚體自身合成C18：3n-3能力有限， 導(dǎo)致魚體中C18：3n-3比例過低而未被檢測出來； 另一方面，由于正常的羅非魚魚體中C18：3n-3比例為0.5%左右，在實驗分析中，形成的色譜峰較低而容易被儀器誤判為雜質(zhì)。
本實驗中，不添加魚油的1.73%組中吉富羅非魚肌肉的n-3 PUFA比例顯著低于其他添加魚油的各組， 同時肝臟的n-3 PUFA比例卻并不顯著低于其他脂肪組，這反饋了一個信息，n-3 PUFA作為淡水魚的必需脂肪酸，其在肝臟中的含量是穩(wěn)定的， 而飼料提供充足的n-3 PUFA 時，n-3PUFA 又在肌肉中大量沉積。吉富羅非魚肌肉中n-6 PUFA比例受顯著飼料影響，同時肝臟的n-6PUFA 比例在各組中無顯著變化，n-6 PUFA雖然是淡水魚類的必需脂肪酸之一，但是吉富羅非魚肝臟中n-6 PUFA 相對含量穩(wěn)定，同時n-6 PUFA在肌肉中的沉積量也有限，n-3 PUFA 更容易在肌肉中沉積，這種差異與肌肉和肝臟具有不同的生物功能有關(guān)。魚體腹腔脂肪組織中總 PUFA含量較低， 主要由SFA和MUFA 組成，其脂肪酸變化仍然受飼料脂肪水平的影響， 只是沒有肌肉和肝臟中變化的明顯。實驗意外地發(fā)現(xiàn)， 吉富羅非魚肝臟中C20：0脂肪酸占總脂肪酸的比例隨飼料脂肪水平提高而顯著上升，變化范圍為2.46%~5.23%，而飼料、肌肉及腹腔脂肪中C20：0比例分別為： 0.42%~0.57%、0.06%~0.24%、0.45%~0.66%，肝臟中的C20：0的比例比飼料、肌肉及腹腔脂肪中的高出很多倍， 而肌肉和腹腔脂肪中該脂肪酸比例與飼料相差較小，說明C20：0在肝臟的脂肪代謝中可能具有特定的作用，有待進(jìn)一步的研究。
