如何提高丹參種子的凈度及進(jìn)行種子質(zhì)量評(píng)定
丹參為唇形科鼠尾草屬植物。又名紫丹參、紅根、血參、大紅袍等，藥用部分為干燥根和根莖。隨著丹參藥材需求量的增加，栽培面積也隨之增大。種子育苗移栽是丹參生產(chǎn)上最常用的方法，少數(shù)地區(qū)也用分根繁殖。丹參種子繁殖比分根繁殖簡便快，而且移栽苗成活率高、長勢整齊。但是，由于丹參花期長，受自然條件的影響大，造成種子成熟度不一致，出苗率低，在自然條件下丹參種子的萌發(fā)一般只有30% ~40%，且出苗不齊。丹參種子易霉?fàn)�、不耐貯藏，陰濕、高溫都使種子迅速劣變。目前中藥材種子生產(chǎn)還多為一家一戶小規(guī)模經(jīng)營，由于各地氣候差異和種子儲(chǔ)藏的條件和習(xí)慣不一致，使得種子質(zhì)量難以控制。本研究對(duì)丹參種子的凈度分析、質(zhì)量測定、真實(shí)性鑒定、水分測定方法，生活力的檢測方法進(jìn)行了研究，為丹參種子質(zhì)量檢驗(yàn)提供依據(jù)。
1 材料
于2004年6月間在丹參主產(chǎn)區(qū)收集人工栽培的丹參當(dāng)年產(chǎn)種子。編號(hào)分別為山東萊蕪(BB，BW，BL，ML)、平邑(LⅠ， LⅡ， SⅠ)、臨朐(SFⅡ，LQ)、曲阜(Q)。
2 方法
2.1 凈度分析
2.1.1 一份全試樣法
取LQ，Q， BL，ML， BB， BW6份丹參種子。采用“徒手減半法”從每份樣本中分取試驗(yàn)樣本80 g左右。將試樣分離成干凈種子、其他植物種子和一般雜質(zhì)3種成分后分別稱重，以g表示，計(jì)算凈種子質(zhì)量百分率、其他種子質(zhì)量百分率、雜質(zhì)質(zhì)量百分率，在種子凈度檢驗(yàn)臺(tái)上進(jìn)行凈度分析。
2.1.2 丹參實(shí)粒種子的清選
丹參種子空殼和癟粒情況嚴(yán)重，而且從外觀不易區(qū)分，尋找一種分離出丹參空殼與實(shí)粒種子的簡便方法。選取BW，BB，LQ，LⅡ，SⅠ，SFⅡ6份種子，分別用以下方法進(jìn)行處理：
水分離法：常溫下，將種子浸泡于水中24 h，取上層的種子，用解剖刀逐粒剖開，將空殼和實(shí)粒的種子分別計(jì)數(shù)。再取下層的種子，與上層種子同樣操作。每處理2次重復(fù)，重復(fù)100粒。
風(fēng)選法：取種子30~50 g，用種子吹風(fēng)儀，風(fēng)力由45逐漸上升到54，風(fēng)選3 min后，將種子分成實(shí)粒和空殼兩部分，取其中一部分，隨機(jī)選取2個(gè)重復(fù)，每重復(fù)100粒，用解剖刀逐粒剖開，將空殼和實(shí)粒種子分別計(jì)數(shù)，再用同樣方法測定另一部分種子。
離心法：將種子放入10mL離心管中，蒸餾水為介質(zhì)，平衡后，以2 400 r?mim-1離心10 min。取出上層和下層的種子，用解剖刀逐粒剖開，利用種子數(shù)粒儀將空殼和實(shí)粒的種子分別計(jì)數(shù)，每處理4次重復(fù)，重復(fù)100粒。 經(jīng)過各種方法篩選后的實(shí)粒種子，置于雙層濾紙培養(yǎng)內(nèi)，每皿50粒， 4次重復(fù)， 25℃， 12 h光照發(fā)芽，并觀察其發(fā)芽情況，選出最適方法。
2.2 質(zhì)量測定
本試驗(yàn)中，采取了百粒測定法、千粒測定法來測定丹參種子質(zhì)量。百粒測定法選用的材料為“LQ”，“Q”，“BL”，“ML”，“BB”，“BW”6份丹參凈種子。千粒測定法選用的材料為“SⅠ”，“SFⅡ”，“BB”3份凈種子。
2.3 真實(shí)性鑒定
采用種子外觀形態(tài)法，隨機(jī)數(shù)取100粒凈種子，4次重復(fù)，逐粒觀察丹參種子形態(tài)特征并記錄。
2.4 水分測定
高恒溫烘干法：取“LⅠ”，“LQ”2份丹參凈種子。烘干4 h，最初2 h內(nèi)，每隔15 min取出鋁盒稱重，而后每隔30 min取出稱重，至恒重，取出迅速放入干燥器中冷卻至室溫，約30~40 min后稱重。
2.5 生活力測定
用丹參種子“LⅡ”，“Q”。采用溴麝香草酚蘭法(BTB法)、紅墨水染色法、四唑法以及紙上熒光法分別測定丹參種子的生活力，探討最佳方法。
3 結(jié)果與分析
3.1 凈度分析
3.1.1 不同方法清選丹參實(shí)粒種子
丹參種子由于成熟期長，采收后雖然外觀完整，但種子胚的發(fā)育不一致，許多為空粒，如果把這部分種子當(dāng)作完整種子，將影響種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的進(jìn)一步分析，故需進(jìn)行實(shí)粒種子的分離。用水分離法、風(fēng)選法和離心法清選丹參種子后實(shí)粒種子占的比例分別為86.4%，98.9%，95.8%。以風(fēng)選法效果最佳。
將經(jīng)過3種方法分離出來的實(shí)粒種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，風(fēng)選后的種子發(fā)芽率最高可達(dá)76%，而離心法后種子的發(fā)芽率只有33%，雖然風(fēng)選法和離心法篩選實(shí)粒種子的效率均較高，但離心法篩出的種子發(fā)芽率明顯低于其他2種方法低，說明種子經(jīng)過離心后，種子受到傷害，發(fā)芽率顯著下降(表1)。故采用風(fēng)力篩選法來去除丹參空殼。
表1 不同方法篩取丹參實(shí)粒種子后的發(fā)芽率%
3.1.2 凈度分析
種子的增失差都<5%，檢驗(yàn)結(jié)果有效(表2)。
表2 丹參種子凈度分析結(jié)果%
丹參種子的凈度較低，種子凈度都低于70%，空殼在雜質(zhì)中占有較大比例。由于丹參花期長，種子成熟度很不一致；開花時(shí)容易遇上雨期，引起種子受粉不良，種子發(fā)育不完全，空殼較多。在種子流入市場前沒有經(jīng)過初步的清潔處理，從而凈度較低，影響種子的整體質(zhì)量。
3.2 質(zhì)量測定
丹參種子千粒重較穩(wěn)定。“ML”千粒重最大，為1.99 g，“BB”千粒值最小，為1.81 g，各樣品各測定值之間變異系數(shù)均小于4.0，結(jié)果有效(表3)。
表3 百粒法丹參種子千粒重
用千粒法測定的3份丹參種子的千粒重結(jié)果表明，3份種子2個(gè)重復(fù)之間的差數(shù)都<5%，表明測定結(jié)果有效。
用千粒法和百粒法測定同一份丹參種子樣本千粒重的結(jié)果表明，兩者之間沒有顯著性差異，但與用千粒法的試驗(yàn)過程相比，用百粒法測定丹參種子的千粒重過程相對(duì)簡單，所以丹參種子質(zhì)量的測定宜采用百粒法。
3.3 真實(shí)性鑒定
丹參種子外部形態(tài)特征：小堅(jiān)果，三棱狀長卵形，長2.5~3.3 mm，寬1.3~2 mm，灰黑色或茶褐色，表面為黃灰色糠秕狀蠟質(zhì)層覆蓋，背面稍平，腹面隆起脊，圓鈍，近基部兩側(cè)收縮稍凹陷；果臍著生腹面縱脊下方，近圓形，邊緣隆起，密布灰白色蠟質(zhì)斑，中央有1條C形銀白色細(xì)線。
3.4 水分測定
用高恒溫烘干法，丹參種子在最初的30 min內(nèi)迅速失去水分，隨后失水緩慢；烘干2.5，3，3.5 h時(shí)，測得種子的含水量值趨于穩(wěn)定，故選擇適宜烘干時(shí)間為3h。
3.5 生活力測定
用溴麝香草酚藍(lán)法及紅墨水染色法測定種子生活力，結(jié)果重復(fù)性較差，不能反映種子的真實(shí)生活力。紙上熒光法測定種子生活力時(shí)，發(fā)芽法檢測出的種子平均發(fā)芽率為46%，而熒光法則為15%，誤差較大，故不能用于丹參種子的生活力測定。因此，采用四唑染色法測定丹參種子生活力。
3.5.1 預(yù)濕處理
丹參種子直接浸泡在水中吸水充分，不容易出現(xiàn)破裂和損傷。預(yù)濕2，4，6 h的種子還未充分吸脹，且種皮尚硬；預(yù)濕12h后，種子吸脹充分而不過度，切剖最容易。預(yù)濕18，24h的種子吸水有些過度，組織有些腐軟。故預(yù)濕方法選取為常溫下在蒸餾水中直接浸泡12h。
3.5.2 暴露種子組織的方法
完整剝?nèi)シN皮的染色情況很好，顏色均勻，但是在觀察時(shí)還需再將種子剖開露出胚，操作上費(fèi)工、費(fèi)時(shí)，故不宜采用。沿腹縫線縱切與從子葉末端橫切去2/5的種子染色不太均勻，且不易觀察，也不宜采用。而沿垂直腹縫線縱切去2/5的種子染色情況很好，顏色均勻，也方便觀察，所以最終采用此法。
3.5.3 溶液的濃度和染色時(shí)間
在0.5%的四唑溶液染色，4h內(nèi)完全染色的種子數(shù)隨著染色時(shí)間的增加而增加，此后染色的種子數(shù)目基本不變，且種子染色均勻、深淺適宜(表4)。用5%四唑溶液染色4 h已經(jīng)充分，且4~6 h內(nèi)顏色正常，7 h后顏色過深，不便觀察。故丹參種子生活力測定為0.5%四唑溶液染色4 h。
表4 不同染色時(shí)間下丹參種子染色結(jié)果
3.5.4 生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn)
200粒丹參種子離體胚發(fā)芽試驗(yàn)中，可以看到，完整的胚發(fā)芽，長成的幼苗也是完整的，有些完整胚即使是新鮮的，但也不能發(fā)芽；即使種子胚能生成完整的子葉，一旦根有缺損，也不能生長成正常幼苗；子葉破損面積達(dá)1/2以上的胚不能發(fā)芽；生成的正常幼苗中，子葉若有破損，均是端處或側(cè)邊破損等于或小于子葉總面積的1/3。
根據(jù)200粒丹參種子四唑染色數(shù)據(jù)，擬定出丹參種子生活力四唑染色的鑒定標(biāo)準(zhǔn)(表5)。有生活力種子類：胚全部染色；子葉遠(yuǎn)胚根一端≤1/3不染色，其余部分完全染色；子葉側(cè)邊總面積≤1/3不染色，其余部分完全染色；無生活力種子類：胚完全不染色；子葉近胚根處不染色；胚根不染色；子葉不染色總面積>1/3；胚所染顏色異常，且組織軟腐。
表5 丹參種子離體胚發(fā)芽和四唑染色結(jié)果總計(jì)
4 討論
在種子檢驗(yàn)中，種子質(zhì)量一般可概括為兩個(gè)方面，一是反應(yīng)品種品質(zhì)的純度和真實(shí)性；二是體現(xiàn)種子播種品質(zhì)的凈度、千粒重、發(fā)芽率、生活力、活力、健康度和水分含量等。盡管衡量種子質(zhì)量特性較多，最終目的是要測定種子的種用價(jià)值。我國從20世紀(jì)50年代至今，執(zhí)行的農(nóng)作物種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以純度、凈度、發(fā)芽率和水分4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)種子質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)定級(jí)。但是隨著種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要，在發(fā)達(dá)國家種子質(zhì)量評(píng)價(jià)不再局限于傳統(tǒng)的4項(xiàng)指標(biāo)，對(duì)種子健康度、種子活力和品種純度檢驗(yàn)的要求也日益增多。
丹參種子外表皮上有1層果膠，遇水后迅速吸漲，果膠中的糖類等有機(jī)物溶解，在熒光下會(huì)出現(xiàn)光圈，所以，用熒光法測定丹參種子生活力時(shí)不能夠準(zhǔn)確地分別出死種子與活種子。
山東為我國丹參的主產(chǎn)區(qū)，主要以種子育苗移栽的方式進(jìn)行栽培，且為我國丹參種子的主要產(chǎn)地，近年來，陜西商洛也采用育苗移栽的方式進(jìn)行栽培，而四川中江主要采用分根栽培的方式，因此，以山東產(chǎn)的丹參種子為試驗(yàn)材料具有一定的代表性。
